King K. Rool roubou o estoque de bananas de Donkey Kong, e Donkey Kong precisa de sua ajuda para recuperá-los. Em busca de K. Rool, a horda Kremling impede seu progresso. Kremlings, criaturas semelhantes a crocodilos, incluem Kritters (eles sucumbem a um simples salto na cabeça), Krushas (eles são praticamente indestrutíveis) e outros. Há também outros inimigos que bloqueiam seu caminho, como castores, cobras, abutres. Liderando-os estão chefes covardes, incluindo Very Gnawty, Necky, Queen B. e Dumb Drum, e todos eles barram o caminho com sua própria mistura especial de vilania.
Donkey Kong é acompanhado por Diddy Kong: esses dois primatas diferem significativamente. Por exemplo, Donkey Kong é geralmente mais forte; ele pode destruir a maioria dos inimigos com um único salto e pode levantar barris diretamente sobre sua cabeça para jogá-los mais longe. Por outro lado, Diddy é mais rápido e não tão forte quanto o Burro; ele pode correr muito rápido e fazer cambalhotas. Diddy carrega barris na frente dele, criando um escudo contra ataques frontais.
O jogo é dividido em mundos diferentes, que são divididos em diferentes níveis. Cada nível contém áreas de bônus, onde se pode coletar bananas, medalhões e vidas. No final de cada mundo há um chefe, que geralmente é uma versão maior de um inimigo menor.
O jogo original do Super Nintendo foi lançado mais tarde para os sistemas portáteis da Nintendo. A versão Game Boy Color tem um nível exclusivo (Necky Nutmare) e jogos bônus adicionais, Funky's Fishing e cinco minigames Crosshair Cranky. Houve também a adição de pacotes de adesivos DK colecionáveis espalhados pelos níveis. Esses pacotes de adesivos podem ser impressos usando a Game Boy Printer. O jogo também tem mais duas opções de dificuldade que ficam disponíveis depois de terminar o jogo. Vencer o jogo uma vez permite que o jogador desligue os barris de DK e vencer o jogo uma segunda vez permitirá que o jogador desligue os barris de checkpoint.
A versão Game Boy Advance também tinha jogos bônus adicionais. Ele tem uma versão do Funky's Fishing, mas em vez dos jogos temáticos de mira, agora há o Candy's Dance Studio, que hospeda seis jogos de dança. Há também as adições de um modo de ataque de tempo chamado DK Attack, um modo de dificuldade mais difícil chamado Hero Mode (só pode jogar como Diddy Kong e o jogo não oferece mais barris e checkpoints Donkey Kong ao longo dos níveis) e a ideia do livro de adesivos de a versão Gameboy Color foi substituída pela coleta de fotos de scrapbook..