DOOM 64 continua de onde todos os outros jogos de DOOM pararam. Depois de rasgar o espaço, o inferno e qualquer outro lugar nos jogos anteriores, a Marinha Espacial pensou que a ameaça dos demônios finalmente havia passado. Claro, um sobreviveu, e atualmente está reanimando todos os monstros caídos em uma última tentativa de revitalizar sua missão maligna. A tarefa do jogador é finalmente livrar o universo de todos os infernos loucos, desde o cara morto com a pistola até o Cyberdemônio vomitando foguetes.
O jogo é muito diferente do DOOM original; ele tem sprites totalmente novos para os monstros, novas texturas, efeitos pseudo-3D (como pontes), iluminação colorida, céus de rolagem e script personalizado que permite efeitos como ambientes de transformação e itens de desova. Os níveis são completamente novos. Existem 32 níveis no total, incluindo vários "níveis divertidos" desafiadores que não podem ser acessados na jogabilidade normal.
A lista de inimigos é semelhante a Doom II. Embora vários inimigos de Doom II não estejam incluídos, um novo monstro foi adicionado: o "nightmare imp", que se move e ataca duas vezes mais rápido que um imp normal. O chefe final do jogo também é novo. O jogo apresenta uma nova arma, a Unmaker, que pode ser atualizada com "chaves demoníacas" encontradas em níveis secretos.
A atmosfera do jogo é ainda mais sombria do que os jogos Doom originais, em parte devido à nova trilha sonora: em vez de músicas rockin' metal, a música consiste em sons ambientes assustadores e drones.
O relançamento de 2020 adiciona sete novos níveis, incluindo um episódio de seis níveis "The Lost Levels".