Ambientado em 1476 na Itália, 285 anos depois do primeiro Assassin's Creed, esta segunda edição traz novos tipos de missões em Veneza, Florença e Roma, onde Ezio Di Firenzi adquirirá a habilidade necessária para se tornar um assassino, e administrar uma vila que pertence a sua família, chamada Monterigione, construída por Altair.
Além de esquivar-se silenciosamente sobre os telhados fugindo de guardas, escalar paredes e usar técnicas mortais de luta, ele encontrará personagens famosos da história italiana, inclusive Leonardo Da Vinci, que poderá lhe fornece novas armas e instrumentos. Mas, o que no início era uma vingança pessoal, levará Ezio ao centro de uma conspiração que jamais poderia ser imaginada.
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