Em 23 de julho de 1998 a divisão de elite do Departamento de Elite de Raccon City (R.P.D) a S.T.A.R.S time Bravo é enviada para investigar estranhos assassinatos nas Montanhas Arklay, região próxima de Raccon. Quando estavam chegando no local, o helicóptero do esquadrão sofre uma pane e é forçado a fazer um pouso na floresta. A equipe se separa para investigar o local e achar ajuda.
A jogabilidade de Resident Evil Zero permanece a mesma de Resident Evil , mas agora ao invés de controlar um único personagem durante a campanha, o jogador controla dois protagonistas durante todo o jogo, sendo eles Rebecca Chambers e o ex-policial Billy Coen. Cada um deles tem suas habilidades e características, por exemplo, Rebecca possui um kit de mistura que faz combinações de ervas e outros produtos químicos, já Billy pode mover objetos pesados.
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